El efecto del micofenolato de mofetilo sobre los podocitos en la nefritis sérica nefrotóxica

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14167 (2023) Citar este artículo

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El micofenolato de mofetilo (MMF) se aplica en las enfermedades renales proteinúricas, pero aún se desconoce el mecanismo exacto de su efecto sobre los podocitos. Nuestros experimentos in vitro anteriores sugirieron que el MMF puede mejorar el daño de los podocitos mediante la restauración del eje del citoesqueleto de actina-Ca2+. El objetivo de este estudio fue caracterizar la biología de los podocitos durante el tratamiento con MMF en la nefritis por suero nefrotóxico (NTS) (NTN). La NTN se indujo en ratones de tipo salvaje de tres semanas de edad. El día 3, la mitad de los ratones fueron tratados con MMF (100 mg/kg de peso corporal/día por vía oral) durante una semana. El día 10, realizamos un análisis proteómico de los glomérulos, así como imágenes de súper resolución del diafragma hendido. Para obtener imágenes multifotónicas de la concentración de Ca2+ ([Ca2+]i), el diseño experimental se repitió en ratones que expresaban un sensor de Ca2+ específico de podocitos. MMF mejoró la proteinuria y la formación de media luna inducida por NTS. Identificamos cambios significativos en la abundancia de proteínas involucradas en la señalización de Ca2+ y la regulación del citoesqueleto de actina, lo que se confirmó aún más mediante imágenes directas de [Ca2+]i en podocitos que muestran niveles disminuidos de Ca2+ después del tratamiento con MMF. Esto se asoció con una tendencia a la restauración de la estructura del proceso de los podocitos del pie. Aquí, proporcionamos evidencia de que el MPA tiene un efecto directo sustancial sobre los podocitos. El MMF contribuye a la mejora de la [Ca2+]i y a la mejora del citoesqueleto de actina desorganizado en los podocitos. Estos datos amplían el conocimiento de los efectos directos de los inmunosupresores sobre los podocitos que pueden contribuir a un tratamiento más eficaz de las glomerulopatías proteinúricas con los menores efectos secundarios posibles.

Las glomerulopatías representan entre el 5% y el 14% de los niños con enfermedad renal crónica y entre el 15% y el 29% de los niños con insuficiencia renal en todo el mundo1. Muchos pacientes con glomerulopatías sólo pueden mantenerse en remisión mediante un tratamiento prolongado con esteroides. Sin embargo, el uso de este fármaco durante un tiempo prolongado produce efectos adversos graves. Por lo tanto, especialmente los pediatras han estado investigando opciones terapéuticas alternativas ahorradoras de esteroides como el micofenolato mofetilo (MMF) en esta población vulnerable2.

El MMF, el profármaco del ácido micofenólico (MPA) biológicamente activo, actúa como un inhibidor potente y reversible de IMPDH, la enzima clave en la biosíntesis de novo de purinas en linfocitos en proliferación, suprimiendo así las respuestas inmunes mediadas por células y la formación de anticuerpos3. El primer estudio sobre los efectos renales del MMF demostró que previene el proceso de rechazo crónico de aloinjertos al disminuir la expresión de moléculas de adhesión y citoquinas en los glomérulos, previniendo así la glomeruloesclerosis4. En las últimas dos décadas, el MMF se ha establecido y se ha utilizado ampliamente también en las glomerulopatías inflamatorias5.

Más allá del efecto inmunosupresor bien caracterizado, sabemos poco sobre cómo el MMF actúa directamente sobre el tejido renal, especialmente los podocitos6,7. En la nefropatía diabética, se observó una menor tasa de apoptosis de los podocitos y una expresión conservada de nefrina y podocina en el grupo tratado con MMF8. Esto está de acuerdo con los resultados en un modelo de puromicina donde la inhibición de IMPDH restableció la reserva de ATP, que retuvo la expresión de nefrina y sinaptopodina y estabilizó el citoesqueleto de actina9. Además, Fu et al. mostraron un efecto directo del MMF en una enfermedad renal inmunomediada: ratones MRL/lpr fueron tratados con MMF. Posteriormente, la secuenciación de ARN realizada en corteza renal aislada mostró una disminución significativa de la expresión del gen Rac1, que altera la formación de fibras de estrés fisiológico cuando se activa10. En consonancia con eso, nuestros experimentos in vitro anteriores que realizaron la secuenciación de ARN de una línea celular de podocitos tratada con MPA revelaron una acumulación de los términos "citoesqueleto de actina" y "regulación de la transducción de señales mediada por GTPasa pequeña". Además, también se enriquecieron los términos “actividad del canal de calcio” y “transporte de iones de calcio”11. El aumento de la concentración de calcio intracelular ([Ca2+]i) en los podocitos12 puede provocar una reorganización aguda del citoesqueleto de actina o incluso un colapso citoesquelético y proteinuria13,14,15,16. En el presente estudio, queríamos confirmar si el MMF también es capaz de mejorar el daño de los podocitos mediante la restauración del eje del citoesqueleto Ca2+-actina en un modelo in vivo de nefritis sérica nefrotóxica (NTN).

Los ratones C57BL6, así como los ratones Pod:cre tg/wt GCaMP3 fl/fl con antecedentes genéticos C57BL6, se alojaron según las condiciones estandarizadas específicas libres de patógenos en las instalaciones para animales de la Universidad de Colonia. Los ratones GCaMP3 fueron proporcionados por JAX Laboratories (cepa 014538), los ratones Pod:cre17 provienen de una colonia establecida (> 10 años) en nuestro vivero. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes proporcionadas por LANUV NRW (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen/Agencia Estatal para la Naturaleza, el Medio Ambiente y la Protección del Consumidor de Renania del Norte-Westfalia). El protocolo experimental fue examinado y aprobado por LANUV NRW (VSG81-02.04.2020.A052), que se adhirió a los principios de las 3R. Cada ratón se consideró como n = 1. En total, 13 ratones (5 hembras, 8 machos) constituyeron el grupo de control, 11 ratones (7 hembras, 4 machos) el grupo NTS + veh y 12 ratones (7 hembras, 5 machos) el grupo NTS. + grupo MMF. Se indujo NTN en ratones de tres semanas de edad (la nefrogénesis ya está completa, pero aún no son sexualmente maduros) de la siguiente manera: Los animales recibieron una inyección intraperitoneal de suero nefrotóxico (NTS; Probetex, San Antonio, EE. UU.) en una dosis de 10 µl. /g de peso corporal (PC) en dos días consecutivos. Desde un punto de vista patogénico, el término históricamente acuñado "nefrotóxico" es engañoso ya que el suero induce un proceso mediado por el sistema inmunológico. En detalle, los anticuerpos nefrotóxicos (anticuerpos heterólogos de oveja producidos contra glomérulos completos de rata) se depositan en todo el glomérulo, incluidas las áreas subepitelial y subendotelial, así como el mesangio. Posteriormente se puede observar proliferación mesangial y formación de medias lunas. Por tanto, la NTN sirve como modelo para la glomerulopatía inmunomediada con proteinuria (Fig. 1a). En nuestro estudio, todos los ratones inyectados con NTS mostraron proteinuria el día 3. Los ratones sin inducción de NTS sirvieron como control. No se controlaron los factores de confusión. El día 3, se administró agua (NTS + veh) o MMF (Roche, Mannheim, Alemania) en una dosis de 100 mg/kgBW/d (NTS + MMF) por sonda oral durante siete días. Luego fueron anestesiados con ketamina y xilazina seguidos de una muestra de sangre cardíaca y sacrificados mediante perfusión cardíaca con solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría. Dependiendo de la técnica de examen adicional, los ratones fueron perfundidos adicionalmente con paraformaldehído al 4%. Se extrajeron los riñones y se colocaron en agarosa derretida para cortes de riñón agudo (AKS) o en formalina tamponada neutra al 4 % para obtener imágenes de agotamiento de emisiones estimuladas (STED). Se tomaron muestras puntuales de orina antes de la inyección con NTS, el día 3 y el último día. El diseño experimental se muestra en la Fig. 1b.

El panel (a) muestra el mecanismo patogénico subyacente de la nefritis sérica nefrotóxica. Los anticuerpos nefrotóxicos (anticuerpos heterólogos de oveja producidos contra glomérulos completos de rata) (rojo) se depositan en todo el glomérulo, incluidas las áreas subepitelial y subendotelial, así como en el mesangio, lo que histológicamente conduce a la proliferación mesangial (azul) y la formación de media luna (negro) y clínicamente a la inmunidad. Glomerulopatía mediada con proteinuria. En el momento de la recolección, las células glomerulares se encuentran en un entorno inflamatorio complejo (púrpura) con predominio de células Th17 y Th1 acompañadas de cDC2 proinflamatorias y células cDC1 de contrapeso. Creado con BioRender.com El panel (b) muestra el diseño y el cronograma de nuestro estudio. Se indujo nefritis sérica nefrotóxica en ratones de tres semanas mediante inyección intraperitoneal de suero nefrotóxico durante dos días consecutivos. El día 3, después de la inducción de la proteinuria, se administró por vía oral vehículo o MMF en una dosis de 100 mg/kg de peso corporal/día durante siete días y luego se sacrificaron los ratones. Los ratones sin inducción de NTS sirvieron como control. NTS: suero nefrotóxico, MMF: micofenolato mofetilo.

Los ratones fueron genotipados utilizando ADN aislado de biopsias de oído. Para ratones Pod:cre tg/wt GCaMP3 fl/fl, el ADN se amplificó mediante PCR utilizando REDTaq ReadyMix (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania) y se visualizó mediante electroforesis en gel. Todos los cebadores utilizados y el tamaño de fragmento respectivo detectado en electroforesis en gel se enumeran en Suppl. Tabla 1.

La cuantificación de los niveles de albúmina en orina se realizó con un kit ELISA de albúmina de ratón (ICL/Dunn Labortechnik, Asbach, Alemania) y los niveles de creatinina se midieron con un kit de creatinina en orina (Biomol, Hamburgo, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En los riñones, programados para histopatología, se realizó deshidratación e inclusión en parafina. Se cortó tejido renal y las secciones se transfirieron a portaobjetos de vidrio. Para evaluar la glomeruloesclerosis se realizó tinción con ácido periódico de Schiff (PAS). Brevemente, las secciones se desparafinaron en xileno y posteriormente se rehidrataron en una serie descendente de etanol. Después de una incubación durante 10 minutos en ácido periódico al 0,9% (Carl Roth, Karslruhe, Alemania), reactivo de Schiff (Merck, Darmstadt, Alemania) y hematoxilina de Mayer (Merck), las secciones se deshidrataron en una serie ascendente de etanol y xileno, y se cubrieron con HistoMount (National Diagnostics, Atlanta, EE. UU.). Se utilizó un NanoZoomer S360 (Hamamatsu, Geldern, Alemania) para adquirir imágenes. Para determinar la extensión del daño glomerular, se contó de forma ciega el número de glomérulos en media luna. Las medias lunas se definieron como dos o más capas celulares en el espacio de Bowman. Se evaluaron un mínimo de 50 glomérulos por riñón18.

El último día del experimento, 24 h después de la última dosis de MMF, los ratones NTS + MMF se sometieron a un procedimiento de punción en la mejilla que proporcionó la muestra de sangre para MPA-C0 del monitoreo terapéutico de fármacos (TDM), seguido directamente por la última dosis de FMM. Después de 30 min se realizó una extracción de sangre terminal, que sirvió como MPA-C30 de TDM. En consecuencia, se utilizó una estrategia de muestreo limitada. El área estimada de MPA bajo los perfiles de la curva de concentración-tiempo (eMPA-AUC0–24 h) se derivó de las concentraciones plasmáticas de MPA y se calculó basándose en un método de ajuste bayesiano con un modelo de dos compartimentos utilizando el paquete de software farmacocinético MW/Pharm ++ (versión con licencia)19.

Después del sacrificio por dislocación cervical, se perfundieron riñones de ratón de tipo salvaje con Dynabeads para aislar los glomérulos como se describe20. Los glomérulos aislados se resuspendieron en 500 µl de solución salina equilibrada de Hanks 1x y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 °C, luego se eliminó el sobrenadante. Los sedimentos se resuspendieron en 50 µl de tampón SP3 con SDS al 5 % y se centrifugaron nuevamente a 15.000 g durante 5 minutos a 4 °C. Posteriormente, la cromatina se degradó en un sonicador Bioruptor®. Los tubos de reacción se colocaron en una rejilla magnética para retirar las Dynabeads de las muestras. El sobrenadante se hirvió a 95 °C y luego se centrifugó a 15.000 g durante 2 min a 4 °C. La concentración de proteína se determinó mediante un procedimiento estándar utilizando un BCA-kit21. La concentración de cada muestra se ajustó a 4 µg utilizando 1 × soplador SP3. El proteoma glomerular se analizó mediante un sistema de espectrometría de masas que contenía un Q ExactivePlusOrbitrap y un EASY nLC 1000 con una columna analítica C18. El procedimiento detallado se ha descrito en otra parte22. El análisis estadístico se realizó con el software Perseus (versión 1.5.5.3)23 y el paquete limma en R24. Se aplicaron un ANOVA unidireccional y una prueba t de dos muestras para el conjunto de datos después de filtrar proteínas para 3 valores válidos en al menos un grupo. Una proteína detectada se definió como válida cuando se identificaron al menos dos péptidos de la proteína. Las funciones de Limma lmFit, eBayes y topTable se utilizaron con configuraciones predeterminadas en las intensidades de proteínas transformadas log2 filtradas para calcular los valores de p y los cambios de log2 veces. Se asumió que un valor de p de 0,05 era significativo sin corrección adicional para pruebas múltiples. Dentro de esto, las proteínas alteradas con un cambio de pliegue log2 (fc) de ≥|0,58| (fc ≥ 1,5) se clasificaron como alterados de manera relevante. Las proteínas que alcanzaron estos criterios se analizaron más a fondo. Para el análisis funcional se utilizaron GraphPad Prism v.9.0.2, la base de conocimientos de proteínas Uniprot y ShinyGO (v.0.75)25.

Los riñones murinos de ratones Pod:cre tg/wt GCaMP3 fl/fl se extrajeron directamente post mortem y luego se incluyeron en agarosa al 4 % de bajo punto de fusión a 37 °C. El riñón en agarosa se cortó en rodajas de 300 µm de espesor y se mantuvo a 4 °C. Para obtener imágenes, AKS se transfirió a la platina del microscopio que contenía Krebs-Henseleit-Buffer a temperatura ambiente con una infusión de 95% de O2 y 5% de CO2. Las imágenes ex vivo se adquirieron utilizando un microscopio multifotónico vertical (TCSSP8 MP-OPO, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). El láser multifotónico (Chameleon VisionII, Coherent, Dieburg, Alemania) se ajustó a 940 nm, se utilizó un objetivo de agua de 25 × (apertura numérica de 0,95) y las imágenes se registraron aplicando un detector híbrido no desescaneado con un FITC/TRITC (525 /50) juego de filtros. Las pilas en Z se tomaron en pasos de 2 µm. Para el análisis de los niveles de Ca2+ en podocitos, se colocaron ROI en proyecciones de intensidad máxima de pilas z de glomérulos individuales y la intensidad de fluorescencia media se cuantificó con ImageJ. Un observador ciego al tratamiento tomó imágenes y analizó al menos veinte glomérulos por corte y dos cortes por animal.

El protocolo de limpieza óptica e inmunomarcaje se realizó como se describió anteriormente26,27. Suplente. La tabla 2 muestra los anticuerpos utilizados. La cuantificación de la longitud de SD siguió los métodos descritos anteriormente27 utilizando una macro ImageJ, que se puede encontrar en GitHub gist: https://gist.github.com/github-martin/e699d18ae6cfa5b1a6aace15d3c3544c.

Todos los métodos se informan de acuerdo con las pautas de ARRIVE.

Todos los ratones mostraron proteinuria severa el día 3 (Fig. 2a). La proteinuria promedio en este momento, antes del inicio del tratamiento con MMF, no difirió significativamente entre los ratones NTS + veh y NTS + MMF. Es importante destacar que el tratamiento de una semana con MMF resultó en una diferencia notable en la reducción de la proteinuria en comparación con el grupo NTS + veh (Fig. 2b). De acuerdo con eso, el análisis histológico mostró un aumento significativo en el número de glomérulos en forma de media luna en el grupo NTS + veh, mientras que los animales NTS + MMF presentaron una media luna glomerular significativamente menor (Fig. 2c). La exposición efectiva a la administración de MMF se confirmó mediante TDM; el eMPA-AUC0–24 h promedio fue de 25,6 ± 13,9 mg*h/L.

La terapia con MMF atenúa el daño renal en el modelo NTN. El panel (a) muestra el índice de albúmina-creatinina en orina el día 3. La proteinuria de NTS + veh y NTS + MMF no difirió significativamente. El panel (b) muestra el índice de albúmina-creatinina en orina el día 10. El tratamiento de una semana con MMF en una dosis de 100 mg/kg de peso corporal/día dio como resultado una diferencia moderada en la reducción de la proteinuria en la nefritis sérica nefrotóxica. El panel (c) representa el porcentaje de glomérulos en media luna en cada grupo. Los animales NTS + MMF presentaron una media luna glomerular significativamente menor en comparación con los ratones NTS + veh. NTS + vehículo n = 4; NTS + MMF n = 4. Se utilizó la prueba t no pareada para determinar la significación estadística. La significación se alcanzó en p < 0,05. Los datos se presentan como media ± DE. NTS: suero nefrotóxico, MMF: micofenolato mofetilo, ns: no significativo, *** p < 0,001* p < 0,05.

Para dilucidar los mecanismos moleculares durante la terapia con MMF en NTN, realizamos proteómica de glomérulos de controles sanos, ratones NTS + veh y NTS + MMF. En total se detectaron 3.650 proteínas glomerulares. De ellas, 173 proteínas estaban reguladas negativamente y 192 proteínas estaban reguladas positivamente de manera significativa (valor de p <0,05) y relevante (cambio lineal de > 1,5) al comparar NTS + MMF con grupos NTS. Para aclarar las funciones moleculares y los procesos biológicos afectados por las proteínas reguladas por MMF, realizamos análisis de ontología genética (GO). La Figura 3 muestra una selección de términos GO importantes. A partir del análisis de enriquecimiento, pudimos esbozar dos grupos principales de términos que fueron de particular interés: señalización de Ca2+ y regulación del citoesqueleto de actina (Fig. 3a, b). De las numerosas proteínas identificadas con un valor de p <0,05 (Tabla complementaria 3), analizamos las relacionadas con la señalización de Ca2+ y/o la regulación del citoesqueleto de actina que se muestran como un mapa de calor (Fig. 4a, b). Además, la distribución de las proteínas más relevantes para la señalización de Ca2+ y la regulación del citoesqueleto de actina se muestra en el gráfico del volcán (Fig. 4c). Para la señalización de Ca2+, dos proteínas atrajeron nuestro interés (Tabla complementaria 3). Wbp2, que conduce a la entrada de Ca2+ desde el RE hacia el citoplasma. Además, Stim2, que es responsable del flujo de Ca2+ desde el líquido extracelular al intracelular. Ambos estaban significativamente regulados a la baja en ratones NTS + MMF en comparación con el grupo NTS + veh. En línea con eso, detectamos cambios significativos en la expresión de proteínas dependientes de Ca2+ como Cpne1, Cpne4, Cpne8, Fbln1, Fbln2 y Rasgrp2 (Tabla complementaria 3). Otro grupo de proteínas alteradas participó en la regulación del citoesqueleto de actina. El nivel de expresión de proteínas de varios reguladores positivos para Rac1, como Micall2, Dock7, Trio y Fgd5, estuvo altamente regulado a la baja en el grupo NTS + MMF frente a NTS + veh (Tabla complementaria 3). La reducción significativa en el nivel de expresión de la proteína Wasf2 posterior también apunta en esta dirección (Tabla complementaria 3). Además, encontramos que el nivel de expresión de Arhgap29, un regulador positivo para RhoA, está altamente regulado (Tabla complementaria 3). Estaba en línea con el aumento del nivel de proteína de Spn y Eif5a, que se sabe que promueven la formación de fibras de estrés (Tabla complementaria 3). Finalmente, observamos una disminución del nivel de expresión de los lamellipodios que inducen Shank3 (Tabla complementaria 3).

Análisis funcional de proteínas alteradas significativamente (p <0,05) y relevante (log2 veces cambio>|0,58|) del proteoma de los glomérulos analizadas mediante el análisis de enriquecimiento de ontología genética (GO) ShinyGo. El panel (a) muestra la comparación entre NTS y ratones de control (efecto NTS). El panel (b) muestra la comparación entre ratones NTS + MMF y NTS + veh (efecto de la terapia). A la izquierda: el gráfico de paleta de funciones moleculares GO alteradas; a la derecha: análisis de red de las funciones moleculares GO alteradas. Controles n = 4; NTS + vehículo n = 4; NTS + FMM n = 6; NTS: suero nefrotóxico; MMF: micofenolato mofetilo.

El panel (a) muestra el mapa de calor de las proteínas relacionadas con la vía "Señalización del calcio", mientras que el Panel (b) muestra el mapa de calor de las proteínas relacionadas con la vía "Citoesqueleto de actina". Las proteínas que mostraron un nivel de expresión significativamente diferente en el grupo NTS + veh en comparación con los controles se consideraron "efecto NTS". Mientras que las proteínas que mostraron un nivel de expresión significativamente diferente en el grupo NTS + MMF en comparación con el grupo NTS + veh se consideraron "efecto de terapia". Un nivel de expresión sin cambios en la fila central (NTS + MMF versus control) indicó una reversión al estado normal mediada por la terapia, lo que sugiere que MMF restauró efectivamente vías celulares específicas. El valor de p < 0,05 está marcado con un asterisco *; El mapeo de colores muestra el cambio de cada proteína: el azul representa la regulación negativa, mientras que el naranja representa la regulación positiva. El panel (c) destaca proteínas interesantes en un gráfico de volcán a partir de la comparación NTS + veh frente a NTS + MMF. Controles n = 4; NTS + vehículo n = 4; NTS + FMM n = 6; NTS: suero nefrotóxico, MMF: micofenolato mofetilo.

La exposición efectiva al MPA se confirma indirectamente mediante la regulación positiva compensatoria de IMPDH2, el objetivo principal del MPA (consulte el repositorio PRIDE).

Para determinar cuantitativamente el [Ca2+]i, utilizamos una línea de ratón transgénico con expresión específica de podocitos del indicador Ca2+ GCaMP3 para un enfoque de imágenes multifotónicas en AKS. Las imágenes multifotónicas revelaron una baja fluorescencia de GCaMP3 en podocitos sanos de los controles y solo variaciones menores entre varios glomérulos (Fig. 5a). La inducción con NTS indujo potentemente un aumento pronunciado en [Ca2+]i en podocitos como lo indican los cambios en la fluorescencia de GCaMP3 (Fig. 5b, d, e). El tratamiento con MMF resultó en una disminución moderada, pero significativa, en la [Ca2+]i de podocitos (Fig. 5c, d, e).

Imágenes representativas de un glomérulo de un ratón Pod:cre GCaMP3 (verde) representan la señal de calcio en el modelo de nefritis sérica nefrotóxica. El panel (a) muestra una baja intensidad de señal de [Ca2+]i fisiológico con sólo variaciones menores entre diferentes glomérulos. El panel (b) demuestra la pronunciada intensidad de la señal de la respuesta de Ca2+ inducida por NTS. El panel (c) presenta una disminución moderada, pero significativa, en la intensidad de la señal, lo que indica una [Ca2+]i total más baja en los podocitos después del tratamiento con MMF. El panel (d) muestra la cuantificación de la señal de Ca2+, donde los valores corresponden a la intensidad fluorescente promedio de un glomérulo y el Panel (e) muestra la cuantificación de la señal de Ca2+, donde los valores corresponden a la intensidad fluorescente promedio de un ratón. Barra de escala: 20 µm. controles n = 5; NTS + vehículo n = 5, NTS + FMM n = 3; Para la cuantificación se utilizaron al menos veinte glomérulos por corte y dos cortes por animal. Se utilizaron ANOVA unidireccional y una prueba t de dos muestras para determinar la significación estadística. La significación se alcanzó en p < 0,05. Los datos se presentan como media ± DE. **** p < 0,0001, ** p < 0,01 * p < 0,05; NTS: suero nefrotóxico, MMF: micofenolato mofetilo, veh: vehículo; ns: no significativo.

Para evaluar los cambios ultraestructurales de la morfología del proceso del pie, utilizamos imágenes de glomérulos de súper resolución STED. Cuantificamos las alteraciones morfológicas midiendo la longitud de la SD visualizada mediante inmunotinción con nefrina. Los animales de control mostraron patrones de SD densos de procesos de patas (FP) alargados y sanos (Fig. 6a). Por el contrario, los podocitos lesionados por NTS exhibieron cambios morfológicos como una reducción en el número y ensanchamiento de los FP, así como un acortamiento significativo de la longitud de la SD (Fig. 6b). Es importante destacar que la terapia con MMF mejoró estos cambios morfológicos (Fig. 6c). Aunque la Fig. 6d, e demuestra una tendencia clara, no se encontraron diferencias significativas entre los ratones NTS + MMF y NTS + veh. Es de destacar que un patrón de SD saludable indica un citoesqueleto de actina intacto, como lo demuestra una tinción conjunta con sinaptopodina, mientras que el ensanchamiento y acortamiento de los procesos del pie se acompañan de una alteración de las fibras de estrés de actina (Figura 1 complementaria).

Microscopía STED de la arquitectura del proceso del pie de los podocitos en un modelo de nefritis nefrotóxica. El resultado de la segmentación SD semiautomática junto con el ROI asignado manualmente se muestra como una superposición en todas las imágenes (amarillo). El panel (a) muestra un patrón de tinción regular y saludable de los procesos del pie delineados por la tinción con nefrina. El panel (b) ilustra los cambios morfológicos después de la inducción de NTS, donde el patrón de tinción de nefrina parece menos denso, lo que resulta en un acortamiento significativo de la longitud de la SD. El panel (c) demuestra una leve tendencia a la normalización de las alteraciones ultraestructurales de los procesos del pie. El panel (d) muestra la cuantificación de la longitud de la SD, donde los valores corresponden al promedio de un glomérulo y el Panel (e) muestra la cuantificación de la longitud de la SD, donde los valores corresponden al promedio de un ratón. Barra de escala: 5 µm; controles n = 5, NTS + veh n = 4, NTS + MMF n = 3; Para la cuantificación se utilizaron al menos cinco imágenes por ratón. Se utilizaron ANOVA unidireccional y una prueba t de dos muestras para determinar la significación estadística. Los datos se presentan como media ± DE. **** p < 0,0001, *** p < 0,001; NTS: suero nefrotóxico, MMF: micofenolato mofetilo, veh: vehículo; ns: no significativo.

Este es el primer estudio que investiga los efectos moleculares del MMF a nivel del proteoma glomerular en un modelo NTN con un protocolo de tratamiento clínicamente relevante. Descubrimos que el MMF mejoró la proteinuria y la formación de media luna glomerular en una semana. Identificamos cambios significativos en la expresión de proteínas relacionados con la señalización de Ca2+ y la regulación del citoesqueleto de actina, lo que se confirmó mediante imágenes directas de [Ca2+]i en podocitos que muestran una mejora después del tratamiento con MMF. Este cambio funcional resultó en una tendencia hacia la estabilización estructural de los FP de podocitos. Por lo tanto, nuestros datos indican que el MMF tiene un efecto beneficioso sobre la NTN parcialmente mediante la restauración del eje del citoesqueleto Ca2+-actina en los podocitos.

El modelo NTN posee varias ventajas de un patomecanismo desencadenado inmunológicamente y una fase de inducción rápida. Esto nos permitió investigar ratones jóvenes de cuatro semanas y media de edad, cuando los riñones aún están creciendo, para modelar los cambios inmunológicos dinámicos en nuestra población pediátrica. Además, nuestro protocolo de inducción y tratamiento refleja la realidad clínica de las glomerulopatías infantiles, ya que el inicio de la terapia no fue preventivo, sino que se mantuvo durante tres días después de la inducción de la enfermedad hasta un punto en el que todos los animales de experimentación exhibieron proteinuria. Para monitorear las dosis aplicadas, establecimos TDM mediante MPA-AUC0–24 h, que es la primera vez que se implementa en un modelo de ratón. Al realizar TDM de MPA, pudimos mostrar una exposición efectiva al MPA. Sabemos por estudios clínicos previos que un MPA-AUC estimado refleja la exposición al MPA de manera más confiable y se correlaciona mejor con el resultado clínico que los valores de MPA-C028,29,30.

Intentamos dilucidar las vías diferenciales de señalización molecular que pueden explicar la renoprotección conferida por la administración de la terapia con MMF en nuestro modelo NTN. La comparación de los perfiles proteómicos mostró que los términos de "señal de Ca2+" y "regulación del citoesqueleto de actina" se enriquecieron después del tratamiento con MMF, lo que sugiere su papel en la mejora de la lesión renal en NTN. La remodelación dependiente de Ca2+ del citoesqueleto de actina es un proceso dinámico que permite la adaptación de los podocitos en condiciones fisiológicas y adversas. En consecuencia, la disfunción de este proceso dinámico puede inducir el desprendimiento de la membrana basal y la pérdida de podocitos. Este proceso dinámico se regula modulando la actividad de miembros de la familia Rho de pequeñas GTPasas. RhoA promueve la formación de fibras de estrés para generar procesos estables en el pie. Por el contrario, Rac1 promueve la motilidad celular asociada a enfermedades31,32. Curiosamente, se ha demostrado que algunos de los fármacos inmunosupresores preservan el citoesqueleto de actina de los podocitos10,33,34. De acuerdo con estos datos, encontramos que el MMF tiene un efecto directo sobre el proteoma de las células glomerulares (Fig. 7): el MMF disminuyó la expresión de la proteína Stim2, que regula la entrada de Ca2+ a través de los canales de Ca2+ operados por almacén35,36. Además, el MMF redujo la expresión de la proteína Wbp2, lo que puede influir en la liberación de Ca2+ del ER37. De manera similar a los análisis proteómicos de glomérulos publicados anteriormente, no pudimos cuantificar los canales TRPC, supuestamente debido a su muy baja abundancia. Sin embargo, previamente se demostró que la incorporación de TRPC5 a la membrana requiere Rac139,40,41 activado, que a su vez fue regulado negativamente por MMF en un modelo de lupus murino10. Esto está respaldado por nuestros datos de proteómica donde la expresión de varias proteínas (Trio, Fgd5, Micall2, Dock7), que activan Rac1, disminuyó. Además, Wasf2, un objetivo posterior de la vía Rac1, estaba regulado negativamente, lo que indica una menor activación de Rac1 también en nuestro modelo. Posteriormente, asumimos que el circuito de retroalimentación entre Rac1-TRPC5-Ca2+influx-Rac139 se ve al menos parcialmente interrumpido por MMF. En total, el MMF se dirige a varias vías que reducen el flujo general de Ca2+ hacia el citoplasma, lo que afecta aún más las vías de señalización posteriores. En consecuencia, el MMF puede influir en las funciones celulares cambiando la expresión de proteínas dependientes de Ca2+: por ejemplo, activación de integrinas a través de Rasgrp2, estabilización de la matriz extracelular a través de fibulinas y diversas cascadas a través de copininas. Además, el posible bloqueo del eje calmodulina-calcineurina puede prevenir la escisión de sinaptopodina y RhoA como se describió anteriormente42. Además, el tratamiento con MMF resultó en cambios de expresión de varias proteínas reguladoras de Rac1, todas actuando en la dirección de la inactivación de Rac1. Mientras que la disminución de la expresión de Arhgap29 promovió la activación de RhoA. Por lo tanto, nuestro conjunto de datos sugiere que el MMF media una regulación recíproca de las vías RhoA y Rac1 que conducen a la preservación general de las fibras de estrés y el fenotipo estacionario de los podocitos. Esto quedó además indicado por las alteraciones de proteínas como Spn, Eif5a, Mylpf, Calml4 y Shank3. Nuestro análisis proteómico reveló que el MMF podría influir beneficiosamente en la señal de Ca2+ y facilitar la formación de fibras de estrés. Aunque estos datos se originan a partir de células de todos los glomérulos, es muy probable que estén influenciados por los podocitos, ya que dependen en gran medida de un eje intacto del citoesqueleto Ca2+-actina14. También está en línea con nuestros experimentos in vitro anteriores11, que realizamos para excluir el impacto de las células inmunes y estudiar el efecto directo del MPA sobre los podocitos. Al hacerlo, nuestra secuenciación de ARN de una línea celular de podocitos tratada con MPA reveló una acumulación de términos que incluyen "actividad del canal de calcio", "transporte de iones de calcio", "citoesqueleto de actina" y "regulación de la transducción de señales mediada por GTPasa pequeña". Esto conduce potencialmente a la normalización de [Ca2+]i en los podocitos y a la mejora del citoesqueleto de actina desorganizado demostrado también mediante tinción de inmunofluorescencia11.

Cambios moleculares en podocitos tras el tratamiento con MMF en nefritis sérica nefrotóxica. Al comparar NTS + veh con NTS + MMF, identificamos expresiones de proteínas significativamente modificadas relacionadas con la señalización de Ca2+ que reducen en general la entrada de Ca2+ al citoplasma. Este [Ca2+]i parcialmente normalizado puede influir en la expresión de proteínas dependientes de Ca2+ y prevenir la escisión de sinaptopodina y RhoA. Además, el tratamiento con MMF conduce a cambios de expresión de varias proteínas reguladoras de Rac1, que actúan en la dirección de la inactivación de Rac1. Mientras promueve la activación de RhoA y la expresión de otras proteínas, lo que conduce en general a la preservación de las fibras de estrés y el fenotipo estacionario de los podocitos. La regulación positiva está coloreada en naranja y la regulación negativa, en azul. Los círculos rojos resaltan las vías de señalización (1–3), que están influenciadas por el tratamiento con MMF y pueden conducir a la restauración de [Ca2+]i. Creado con BioRender.com.

Para validar nuestros datos proteómicos sobre proteínas relacionadas con Ca2+ en podocitos, realizamos microscopía multifotónica en AKS de ratones que expresan la proteína sensora [Ca2+]i GCaMP3 específicamente en podocitos13,15. El uso de AKS permite obtener imágenes de muchos glomérulos en tres dimensiones, lo que reduce el sesgo de selección. Esto es particularmente ventajoso en nuestro modelo NTN debido a la población heterogénea de lesiones glomerulares. El aumento de [Ca2+]i es un evento temprano en la lesión de los podocitos12 y el exceso de [Ca2+]i puede conducir a una reorganización aguda del citoesqueleto de actina o incluso al colapso del citoesqueleto13,14,15,16. Por tanto, el control estricto de la [Ca2+]i es esencial en estas células. También detectamos una elevación significativa de [Ca2+]i en nuestro modelo de enfermedad que puede contribuir a la activación de vías de señalización patológica en NTN. Es importante destacar que la terapia con MMF redujo la [Ca2+]i elevada en los podocitos. En resumen, nuestros datos de proteómica e imágenes fueron concordantes: la disminución de la expresión de las proteínas desencadenantes del canal de Ca2+ y la disminución indicada de la tasa de activación de Rac1 en ratones tratados con MMF se confirmaron visualizando directamente la reducción de la [Ca2+]i de los podocitos después del tratamiento con MMF. .

Para validar los datos proteómicos relacionados con la regulación del citoesqueleto de actina y sus consecuencias en la estructura de FP de los podocitos, aplicamos la microscopía STED de FP, que nos permite teñir proteínas de la barrera de filtración26,27. En el presente estudio, detectamos una longitud de SD significativamente reducida en el grupo NTN, lo que indica una disfunción de la barrera de filtración glomerular. Es importante destacar que la terapia con MMF podría mejorar ligeramente la estructura de los PF. La falta de significación estadística podría explicarse por la corta exposición al MMF o el número relativamente bajo de glomérulos analizados en el modelo heterogéneo de NTN. En resumen, nuestros datos STED confirmaron los datos proteómicos al mostrar una tendencia a la restauración de la estructura de FP' y sugerir la estabilización del citoesqueleto de actina en el grupo MMF.

Reconocemos que nuestro estudio también tiene varias limitaciones: (1) Descubrimos que el tratamiento con MMF durante una semana mejoró la proteinuria, aunque no de manera significativa. Por lo tanto, el MMF tiene el potencial de influir beneficiosamente en las vías de señales y los cambios histológicos en NTN, pero la duración de la terapia fue demasiado corta en nuestro modelo reversible o el MMF solo tiene una eficacia limitada para inducir una remisión completa de la proteinuria resultante de la interacción de un gran cantidad de vías de señalización posteriores. (2) Tampoco pudimos resolver la señalización del microdominio Ca2+ en la membrana celular utilizando nuestro indicador de calcio citosólico, ya que las imágenes de [Ca2+]i mediante microscopía multifotónica sirven más bien como una lectura indirecta de todos los canales de Ca2+ que muestran el [Ca2+]i total. . Sin embargo, este aumento de [Ca2+]i en todo el podocito refleja una ruptura de los mecanismos para controlar la señalización del microdominio Ca2+. En nuestra opinión, esto podría reflejar aún mejor el estado general de los podocitos. (3) Dado que nuestro estudio se centró en los podocitos, no podemos descartar que el MMF mejoró simultáneamente la función de las células mesangiales lesionadas y las células endoteliales glomerulares, por lo que los efectos observados en los podocitos también podrían haber estado influenciados por la comunicación cruzada celular glomerular alterada. (4) Finalmente, fue un desafío diferenciar claramente los efectos sistémicos de la inmunosupresión por MMF versus sus efectos directos sobre las células glomerulares, ya que están inseparablemente conectados en un modelo in vivo, aunque esto se parece a la situación en nuestros pacientes. Sin embargo, creemos que la aplicación de imágenes dirigidas de [Ca2+]i y estudios STED de podocitos ayudó a comprender el efecto directo específico en los podocitos.

En resumen, identificamos vías de señalización en los glomérulos regulados por MPA y revelamos una nueva comprensión mecanística de cómo el MMF reduce la proteinuria de una manera específica para los podocitos, más allá de su efecto inmunosupresor sistémico: el MMF contribuye a la normalización de [Ca2+]i y mejora el citoesqueleto de actina desorganizado. en los podocitos mejorando así la función de barrera glomerular. En conclusión, nuestro estudio proporciona la justificación fisiopatológica para utilizar los efectos directos del MMF sobre los podocitos además de su acción inmunosupresora en las glomerulopatías proteinúricas para obtener un tratamiento más eficaz con los menores efectos secundarios posibles.

Los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE43 con el identificador de conjunto de datos PXD039915.

Cortes de riñón agudo

ion calcio

Concentración de Ca2+ intracelular

proceso de pie

Ontología de genes

Inosina-5′-monofosfato deshidrogenasa

Amortiguador de Krebs-Henseleit

Micofenolato de mofetilo

ácido micofenólico

Nefritis sérica nefrotóxica

Suero nefrotóxico

Ácido periódico-schiff

Solución salina tamponada con fosfato

paraformaldehído

Sustrato 1 de toxina botulínica C3 relacionada con Ras

Familia de genes homólogos de Ras, miembro A

diafragma hendido

Agotamiento estimulado de las emisiones

Monitoreo terapéutico de medicamentos.

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Agradecemos a S. Keller, S. Greco-Torres y A. Köserand por su excelente asistencia técnica. Los autores agradecen la excelente ayuda del Centro de Investigación in vivo del CECAD (director: Dr. Zevnik), el Centro de Proteómica del CECAD (director: Dr. Lackmann) y el centro de imágenes del CECAD (director: Dr. Schauss).

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL. AH cuenta con una beca “Gerok Stelle”, una beca de la GPN (Sociedad Alemana de Nefrología Pediátrica) y un estipendio de Peter Stiftung. AH y SAZ fueron financiados con el estipendio de Colonia Fortune. JB-L., MJH y EW recibieron el apoyo de la subvención HA6212/3 de la DFG en el marco del CRU329. PD fue financiado por Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2022_EKEA.90). Agradecemos el apoyo a la tasa de procesamiento de artículos de la DFG (Fundación Alemana de Investigación, 491454339).

Estos autores contribuyeron igualmente: A. Hackl y E. Nüsken.

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina, Hospital Universitario de Colonia, Universidad de Colonia, Kerpener Street 62, 50937, Colonia, Alemania

A. Hackl, E. Nüsken, J. Voggel, SED Abo Zed, G. Fink, C. Dafinger, M. Wohlfarth, K.-D. Nüsken y LT Weber

CECAD, Facultad de Medicina, Hospital Universitario de Colonia, Universidad de Colonia, Colonia, Alemania

A. Hackl, SED Abo Zed, J. Binz-Lotter, D. Unnersjö-Jess, K. Bohl, E. Wiesner, P. Diefenhardt, C. Dafinger, H. Chen, R.-U. Müller, MJ Hackl y B. Schermer

Departamento 2 de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Hospital Universitario de Colonia, Universidad de Colonia, Colonia, Alemania

J. Binz-Lotter, D. Unnersjö-Jess, K. Bohl, E. Wiesner, P. Diefenhardt, H. Chen, R.-U. Müller, MJ Hackl y B. Schermer

Departamento de Monitorización Terapéutica de Medicamentos, Farmacología en el Centro de Laboratorio, Facultad de Medicina, Hospital Universitario de Colonia, Universidad de Colonia, Colonia, Alemania

C. Müller

Centro de Enfermedades Renales Raras de Colonia, Facultad de Medicina, Hospital Universitario de Colonia, Universidad de Colonia, Colonia, Alemania

R.-U. Müller y LT Weber

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Los experimentos fueron diseñados por AH, EN, JV, JB-L., DU-J., CM, MJH, KDN y LTW. Los experimentos fueron realizados por MJH, JV, SEDAZ, JB-L., DU-J., CM, GF, EW, PD, MW, CD y HC El análisis de datos fue realizado por AH, EN, JV, JB-L., DU-J., CM, PD y KB El manuscrito fue escrito por AH, EN, K.-DN y LTWLTW, K.-DN, BS, AH y RUM proporcionaron orientación y recursos.

Correspondencia a A. Hackl.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Hackl, A., Nüsken, E., Voggel, J. et al. El efecto del micofenolato de mofetilo sobre los podocitos en la nefritis sérica nefrotóxica. Representante científico 13, 14167 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41222-1

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Recibido: 28 de abril de 2023

Aceptado: 23 de agosto de 2023

Publicado: 29 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41222-1

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El efecto del micofenolato de mofetilo sobre los podocitos en la nefritis sérica nefrotóxica